Experimentella modeller av artros

Brusk är en högspecialiserad vävnad som innehåller endast en typ av celler (kondrocyter), som kännetecknas av frånvaro av blod och lymfatiska kärl. Bruskens näring utförs huvudsakligen genom absorption från synovialvätskan. Kondrocyternas metabolism regleras av ett antal lösliga faktorer som produceras lokalt av kondrocyter och omgivande vävnader. Funktionen av kondrocyter beror också på kompositionen av det extracellulära mediet (syrspänning, jonkoncentration, pH, etc.), VCM-sammansättning, cell- och matrisinteraktion, fysiska signaler. Den huvudsakliga uppgiften för experimentell modellering är skapandet av kulturer i den extracellulära miljön utan att ändra fenotypen hos mogna celler. Den andra uppgiften är att skapa kulturer för att studera tidigt, fördröjt, kort eller långsiktigt svar av kondrocyter mot kemiska och / eller fysiska signaler. Studier in vitro ger också en möjlighet att studera beteendet hos kondrocyt vid artros. Den tredje uppgiften är att utveckla medhärdande system, vilket möjliggör att studera interaktionerna mellan olika vävnader i fogen. Den fjärde uppgiften är framställning av broskiga implantat för den efterföljande transplantationen. Slutligen är den femte uppgiften att studera tillväxtfaktorer, cytokiner eller terapeutiska medel som kan stimulera reparation och / eller hämma dess resorption av brosk.

Under de senaste decennierna har olika modeller av ledbruskcellsodlingar skapats, inklusive monolagskulturer, suspenderade kulturer, kondronkulturer, explanter, kockkulturer, odödliga cellkulturer. Varje kultur har sina fördelar och nackdelar och var och en lämpar sig för att studera en särskild aspekt av kondrocytmetabolism. Bruskiga explantanter är således en utmärkt modell för att studera matriselementets omsättning, vilket kräver äkta cellyta-receptorer och normal cellmatris och matris-cell-interaktioner. Samtidigt rekommenderas undersökningen av insättningar i matrisen eller mekanismerna för reglering av kondrocytmetabolism att utföras på en kultur av isolerade celler. En monolagd låg densitetskultur är nödvändig för att studera processen för celldifferentiering. Kulturer som är suspenderade i en naturlig eller syntetisk matris är en modell för att analysera det adaptiva svaret av kondrocyter mot mekanisk stress.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

Kondrocytkulturer

Vid val av broskvävnad för in vitro-studier måste flera viktiga punkter beaktas. Kompositionen av matrisen och den metaboliska aktiviteten för kondrocyter varierar i olika leder, och den senare beror också på djupet läge i kondrocyt vävnad. Dessa data erhölls i flera försök, i vilka isolerade subpopulationer av kondrocyter från bruskzonerna av olika djup undersöktes. Ett antal morfologiska och biokemiska skillnader hittades mellan odlade kondrocyter belägna i ytan och djupa skikt av ledbrusk. Ytliga celler syntetiserar sällsynta utarmat fibrillär matris proteoglykaner, medan de djupare celler producerar matris, full av fibriller och proteoglykaner. Dessutom ytliga celler producerar relativt mer små icke-aggregerade proteoglykaner och hyaluronsyra och aggrekan och relativt mindre keratansulfat, de djupare belägna kondrocyter. Ett annat viktigt kännetecken för metabolism av kondrocyter isolerade från bruskzonerna av olika djup är svaret på den exogena stimulansen. Enligt M. Aydelotte et al, kondrocyter från bovina brosket ytareor var mer känsliga för IL-1 än djupa zon celler.

Cellernas beteende beror också på vävnadens placering. Kondrocyter brosk och öronkanter, tagna från samma djur som reagerar olika på tillväxtfaktorer såsom fibroblasttillväxtfaktor (FGF), och TGF-beta. FGF ökad tymidininkorporering, prolin och leucin till kulturen av kondrocyter revben men inte örat. TGF-P ökade införlivandet av tymidin i brosk kondrocyter revben och öron, men hade ingen effekt på tymidininkorporering i kondrocyter och prolin öra. Bruskceller som erhålls från zoner som har störst belastning skiljer sig från de från platser med låg belastning på brosket. Till exempel, mogna kondrocyter från brosk av knäleden från den centrala regionen av får artikulär tibiala benytan som inte omfattas av menisken, som bär den största belastningen in vivo, mindre syntetiserade aggrekan, dekorin men större än cellerna i de områden som omfattas av menisken. Författarna betonar också vikten av att använda brusk från identiska gemensamma zoner när man undersöker den syntetiska funktionen av lederna.

Kondrocyternas metabolism och deras svar på reglerande faktorer beror också betydligt på givarens ålder, utvecklingen av dess skelett och tillståndet i lederna från vilka cellerna tas. I humankondrocyter observeras en signifikant minskning med ålder av det proliferativa svaret. Den största minskningen observeras hos givare i åldrarna 40-50 år och över 60 år. Vidare minskar allvaret av det proliferativa svaret på tillväxtfaktorer (t ex FGF och TGF-beta) under åldring. Förutom kvantitativa förändringar i proliferationen av kondrocyter finns det också kvalitativa förändringar. Unga givarceller (10-20 år gamla) svarar bättre på trombocyt härledd tillväxtfaktor (PDGF) än till TGF-beta, medan motsatsen observeras i vuxna donatorceller. För att förklara de åldersberoende förändringarna i syntetiska funktionen av kondrocyter och deras svar på effekten av tillväxtfaktorer används flera mekanismer. Bland dem, en minskning av antal och affinitet hos ytcellsreceptorer, en förändring i syntesen och bioaktiviteten hos tillväxtfaktorer och cytokiner och modifiering av postreceptorsignaler.

Det patologiska tillståndet hos lederna förändrar också chondrocytes morfologi och metaboliska aktivitet. Så, J. Kouri et al (1996) identifierade tre subpopulationer av kondrocyter i brosk vid osteoartrit. Kondrocyter från den ytliga och övre mitten av brosket bildar kluster och syntetiserar mer proteoglykaner och kollagen. TGF-beta, och insulinliknande tillväxtfaktor (IGF) kan stimulera proteoglykansyntes genom kondrocyter och delvis neutralisera effekterna av IL-1 och TNF-a. Broskexplantat drabbades med osteoartrit och kondrocyterna isolerats från brosk hos patienter med artros, är mer känsliga för stimulering av TGF-beta än friska brosk kondrocyter. Dessa skillnader är sannolikt förknippade med fenotypiska förändringar i kondrocyter i de övre skikten i ledbrusk.

Isolering av individuella kondrocyter uppnås genom sekventiell behandling med proteolytiska enzymer av ECM. Efter deras frisättning från ECM är isolerade celler idealiskt lämpade för att studera syntesen av de novo- matriskomponenter . Vissa författare använder endast clostridiumkollagenas, andra förinkubera brosk med trypsin, pronas, DNas och / eller hyaluronidas. Antalet isolerade celler beror på de använda enzymerna. Sålunda, när de behandlar ett av en g kollagenas vävnad kan erhållas 1,4T0 ⁶ kondrocyter, medan vid användning av pronas, hyaluronidas och kollagenas - 4,3-10 ⁶. Vid behandling med kollagenas förblir aggrecan, proteiner, IL-6, IL-8 i cellkulturen mycket mer än i fallet med sekventiell behandling med olika enzymer. Det finns flera förklaringar för dessa skillnader mellan de två cellkulturerna:

• Cellulära receptorer skadade eller deprimerad genom inverkan av enzymer, inhiberar TGF-beta-DNA-syntes av proteoglykaner i de nyligen isolerade kondrocyter (dag 1), under det att DNA och proteoglykansyntes av kondrocyter odlade i monoskikt (7 dagar) stimulerade av TGF-beta. För att återexpressa dessa membrankomponenter krävs emellertid en tillräcklig period före experimentets början.
• Exogena proteaser kan bryta interaktionen mellan celler och matrisen, medierad av integriner. Integrinfamiljen främjar bindningen av kondrocyter till VKM-molekyler (Shakibaei M. Et al., 1997). Denna ruptur kan påverka uttrycket av matrisgener.
• Rester av matriskomponenter kan reglera den syntetiska funktionen av kondrocyter. Integrins kan känna igen nedbrytningsprodukter från ECM och spelar därmed en viktig roll vid reparation av vävnader efter exponering för proteolytiska enzymer. T. Larsson och medförfattare (1989) rapporterade att tillsatsen av intakta eller fragmenterade pro-teoglykaner till cellodling stimulerar syntesen av proteiner och proteoglykaner. Orsakar emellertid höga nivåer av hyaluronsyra en betydande minskning av införlivandet av sulfat proteoglykansyntes genom kondrocyter kycklingembryofibroblaster kondrocyter mogna svin- och rått kondrosarkomceller. Dessutom hyaluronsyra - inhibitor av proteoglykan frisättning från cellerna även i närvaro av IL-lb, TNF-a, FGF, vilket indikerar att den första motverka den biologiska aktiviteten hos tillväxtfaktorer och cytokiner. Den exakta mekanismen som ligger bakom verkan av hyaluronsyra förblir otydlig; Det är känt att kondrocyter innehåller en receptor för hyaluronsyra, associerad med aktinfilament i cytosolen. Bindningen av hyaluronsyra till dess receptor stimulerar fosforyleringen av proteiner. Sålunda demonstrerar dessa data moduleringen av den metaboliska funktionen av kondrocyter genom fragmenterade eller inhemska molekyler av matrisproteiner genom aktivering av membranreceptorcellerna.
• Den snabba stimuleringen av enzymer av syntesen av matrisproteiner genom kondrocyter kan vara en konsekvens av en förändring i form av kondrocyter och / eller omorganiseringen av cytoskeleten.
• Vissa cytokiner (t.ex. IL-8) och tillväxtfaktorer (t.ex. IGF-1, TGF-P) är fixerade i ECM. Det mest kända exemplet är bindningen av TGF-beta med dekore, vilket leder till en minskning av förmågan hos den förstnämnda att inducera cellulär tillväxt i äggstocksceller i kinesiska hamstrar. De data som innehållet i broskdekoration ökar med ålder, indikerar en minskning av biotillgängligheten av TGF-beta vid åldrandet. Tillväxtfaktorer och cytokiner kan frisättas från matrisrester under odling och sedan modulera kondrocytfunktion.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Monolagskultur av kondrocyter

Den differentierade fenotypen av kondrocyter kännetecknas primärt av syntesen av kollagen av typ II och vävnadsspecifika proteoglykaner, såväl som en låg nivå av mitotisk aktivitet. Det finns belägg för att långvarig odling av celler i ett monolager, och efter flera upprepade passager av celler, kondrocyter förlorar sin sfäriska form, bli långsträckt fibroblast-liknande form. Med sådan fibroblast metaplasi syntetisk funktion modifieras också celler, som kännetecknas av en progressiv minskning i syntesen av kollagener II, IX och XI-typer och förbättrad syntes av kollagen I, III och Utipov. Små icke-aggregerade proteoglykaner syntetiseras genom funktionell aggrecan. Syntetzatepsin B och L är extremt låga i differentierade celler, men i processen med förlust av differentiering ökar. Kollagenas-1 uttrycks i differentierade kondrocyter, med långvarig odling sjunker dess uttryck, medan produktionen av vävnadshämmare av metalloproteaser (TIMP) ökar.

De differentierade kondrocyterna uttrycker igen kollagen av den differentierade fenotypen när de överförs från en enkelskiktskultur till en suspenderad. Differentieringsprocessen är sannolikt relaterad till cellernas form. Denna egenskap används regelbundet av forskare som studerar defekta transplantationer med autologa kondrocyter. Ett litet antal celler erhållna från ett biopsimaterial kan multipliceras i en monolagskultur och placeras sedan igen i en tredimensionell matris före transplantation. Återuttryck av en specifik fenotyp av dedifferentierade kondrocyter överförda till en agaroskultur kan stimuleras med TGF-p, ett ossein-hydroxiapatitkomplex och askorbinsyra.

Som svar på effekten av tillväxtfaktorer och cytokiner modifieras kondrocyter under differentieringsprocessen. Det cellulära svaret på cytokiner och tillväxtfaktorer skiljer sig mellan odifferentierade och differentierade kondrocyter. IL-1 stimulerar proliferationen av fibroblaster, medan tillväxten av odifferentierade kondrocyter inhiberas av IL-1. Syntes av DNA stimuleras av IGF-1 i långsträckta, men inte planade kondrocyter. I de differentierade kondrocyterna är de stimulerande effekterna av IL-1p och TNF-a på prokollagenasprodukter mer uttalade än i odifferentierade.

Odling av kondrocyter

Odlingen av kondrocyter i suspension i ett flytande medium eller i en naturlig eller syntetisk tredimensionell matris stabiliserar kondrocytens fenotyp. Celler behåller sin sfäriska form, syntetiserar vävnadsspecifika proteiner. En viktad kondrocytkultur rekommenderas vanligtvis för studier av bildandet av en ny pericellulär matris. Kondrocytkulturer i syntetiska eller naturliga absorberande polymerer används för att implantera celler i broskfel för att stimulera regenerering av broskvävnaden i leden. Syntetisk eller naturlig miljö för implanterbara celler måste uppfylla ett antal krav:

• Implantat bör ha en porös struktur för vidhäftning och celltillväxt,
• varken polymeren själv eller produkterna av dess nedbrytning bör orsaka inflammation eller toxiska reaktioner under in vivo- implantation ,
• transplantationsbäraren bör kunna binda till ett intilliggande brosk eller subchondral ben,
• en naturlig eller syntetisk matris måste kunna absorberas, dess nedbrytning måste balanseras av vävnadsregenerering,
• För att underlätta bruskreparation borde den kemiska strukturen och matrisarkitekturen hos matrisen bidra till att upprätthålla cellfenotypen kodad av kondrocyterna och syntetisera vävnadsspecifika proteiner,
• under implantation in vivo är det nödvändigt att studera de mekaniska egenskaperna hos den syntetiska eller naturliga matrisen.

[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]

Suspension av kondrocyter i vätskefasen

Cellvidhäftning till plastkärl, i vilket odlingen av kondrocyter kan förhindras deras väggar belagda med en lösning metylcellulosa, agaros, hydrogel (poly-2-hydroxietylmetakrylat) eller en blandning av kollagen-agaros. Under dessa förhållanden bildar kondrocyter kluster och syntetiserar huvudsakligen aggrecan och vävnadsspecifika kollagener (II, IX, XI-typer). Vanligtvis finns två typer av celler. Cellerna i mitten bibehåller en sfärisk form omgiven av en välutvecklad ECM, vilken bekräftas av histokemiska och ultrastrukturella studier. I periferin har kondrocyter discoidkonturer, omgivna av en sällsynt ECM; Lite är känt om de funktionella egenskaperna hos sådana celler.

Odling av kondrocyter på mikrobärare som stöds i suspension är möjlig; Dextranpärlor (cytodex), kollagenbelagda dextranpärlor (cytodex III), icke-tomma mikrosfärer av kollagen typ I (kollagen) används som mikrobärare. Under dessa odlingsbetingelser fäster kondrocyter vid ytan av mikrobäraren, behåller sin sfäriska form och producerar ett matrisliknande material. Vidare främjar användningen av kollagen proliferationen av kondrocyter och reexpressionen av en normal fenotyp. Därför kan odlingen av kondrocyter på kollagenens mikrosfärer användas för att återställa cellfenotypen före transplantation.

En annan metod för odling av en suspension av kondrocyter i ett flytande medium är deras odling i form av täta pärlor bestående av celler (0,5-1 * 10 ^b ) erhållna genom centrifugering. Sådana kondrocyter kan producera en matris innehållande ett stort antal proteoglykaner, kollagen typ II, men inte typ I-kollagen, vilket bekräftas genom histologiska, immunohistokemiska och kvantitativa metoder.

Suspension av kondrocyter i en naturlig ECM

Kondrocyter kan odlas i suspension i en tredimensionell matris (mjuk agar, agaros, kollagengel eller svamp, hyaluronsyra, fibrinlim, alginatpärlor).

Odlade agarosekondrocyter bibehåller sin normala fenotyp och syntetiserar kollagen typ II och vävnadsspecifika aggregat-nya aggregat. När de odlas i agaros frisätts cell-syntetiserade proteoglykaner i mediet i 50 dagar. För jämförelse - i enskiktskultur överfylls cellfasen med glykosaminoglykaner redan under de första 5-6 dagarna av odling; när de odlas i mediet efter syntesen och frisättningen av glykosaminoglykaner intensifieras sker den tidsberoende minskningen av glykosaminoglykaner under de första 8-10 dagarna. Ändå skiljer sig uppförandet av kondrocyter under deras odling i agaros från det i in vivo-betingelser. I agaros innehåller ett stort antal syntetiserade Aggregan-aggregat mindre och mindre molekyler än in vivo. TGF-P stimulerar syntesen av proteoglykaner i explantet, men reducerar syntesen av aggrecan i agaros.

Alginat är en linjär polysackarid härledd från brunt tång. I närvaro av divalenta katjoner, såsom Ca2 ^{+ joner}, blir denna polymer en gel. Varje kondrocyt fångad i alginat, omgiven av en matris av negativt laddade polysackarider, vars porer är jämförbara med de för hyalinbrosk. Matrisen som är bildad kondrocyter i alginatpärlor, som består av två segment - ett tunt skikt av cellassocierad matrisen motsvarande de pericellulära och territoriella matriser av ledbrosk och mer avlägsna matris interterritoriellt motsvarande i naturlig vävnad. På den 30: e odlingsdagen, relativ och absolut volym som upptas av celler, och var och en av de två avdelningarna i alginatpärla är nästan helt identiska med de för nativt brosk. För nästan 30 dagar kondrocyter bibehåller sin sfäriska form och producera aggrekan, hydrodynamiska egenskaper som är liknande de hos aggrekan molekyler i matrisen av ledbrosk och kollagen-molekylen II, IX och XI typer. Samtidigt, liksom andra kulturer, suspensioner, alginatpärlor på ytan av plattade celler är närvarande som genererar en liten mängd av typ I-kollagen-molekyler, släpps ut direkt i miljön och inte förts in i videobandspelaren. I alginatpärlorna observeras måttlig proliferation av kondrocyter. Efter 8 månaders odling i alginatgel mogna kondrocyter inte förlorar metabolisk aktivitet och fortsätter att syntetisera vävnadsspecifika kollagen typ II och aggrecan.

N. Tanaka och coauthors (1984) undersökte diffusionsegenskaperna hos olika naturliga molekyler i alginatet och fann att molekyler större än 70 kD inte diffunderar genom alginatet. Således är odlingen av celler i alginatet lämplig för att studera regleringen av matrisbiosyntes och organisationen av ECM. Tillgängligheten av celler odlade i alginatet medger att man undersöker effekten av peptidregulatoriska faktorer och farmakologiska medel på transkriptions-, posttransskriptions- och translationsnivåer.

Kondrocyter odlas också i en matris av kollagenfibrer I och II typer. S. Nehrer och medförfattare (1997) jämförde funktionen av hundkondrocyter i porösa kollagen-proteoglykanpolymermatriser innehållande kollagener av olika typer. De fann viktiga skillnader i morfologin för den biosyntetiska funktionen av kondrocyter odlade i kollagenmatriser innehållande kollagentyperna I och II. Celler i matrisen av kollagen typ II spolade sin sfäriska form, medan de i typ I-kollagen hade en fibroblastliknande morfologi. Vidare producerade kondrocyter i matrisen av typ II-kollagen mer glykosaminoglykaner. J. Van Susante et al (1995) jämförde egenskaperna hos kondrocyter odlade i alginat- och kollagen (typ I) gelén. Författarna fann en signifikant ökning av antalet celler i kollagen gel, men den 6: e dagen av odlingen, cellerna förlorade sin karakteristiska fenotyp, förvandlas till fibroblastliknande celler. I alginatgelen observerades en minskning av antalet celler, men kondrocyterna behöll sin normala fenotyp. Mängden kollagengel proteoglykaner per cell var signifikant högre än i alginat, men minskningen observerades i gelén matriselement syntes utgående från 6: e dagen av odling, medan i alginat syntes fortsatte att växa.

En solid tredimensionell fibrinmatris är en naturlig substans som stöder kondrocyterna vägda i den i en differentierad fenotyp. 3D-fibrinmatrisen kan också användas som bärare för kondrocyttransplantation. Fördelar med fibrin är frånvaron av cytotoxicitet, förmågan att fylla utrymmet, limningsförmågan. Genom histologiska och biokemiska studier Autoren-diografii avslöjade elektronmikroskopi att kondrocyterna i fibringeler behålla sin morfologi, föröka sig och producera matrisen även efter 2 veckors odling. Emellertid, G. Homminga et al (1993) rapporterade att efter 3 dagars odling, börjar upplösningen av fibrin fortskrider dedifferentiering av kondrocyter.

Suspension av kondrocyter i en artificiell (syntetisk) ECM

Bruskimplantat för rekonstruktiv eller ortopedisk kirurgi kan erhållas genom att odla isolerade kondrocyter in vitro i en syntetisk biokompatibel matris.

Odlade polyglykolsyrakondrocyter prolifererar och upprätthåller normal morfologi och fenotyp inom 8 veckor. Kondrocyt-polyglykolsyrakomplexet består av celler, glykosaminoglykaner, kollagener och har en yttre kollagenkapsel. I sådana implantat finns emellertid två typer av kollagenmolekyler - I och II. Implantat från dedifferentierad av en serie passager av kondrocyter har ett större antal glykosaminoglykaner och kollagen än i implantat från primärt odifferentierade kondrocyter.

L. Freed och medförfattare (1 993b) jämförde beteendet hos humana och tjurkondrocytkulturer i fibrös polyglykolsyra (HPHC) och i polymjölksyra (PPLC). Efter 6-8 veckors odling av tjurkondrocyter i HSVG eller PPLC observerade författarna cellproliferation och bruskmatrisregenerering. I HSBC var kondrocyterna sfäriska, belägna i luckor omgivna av en broskig matris. Efter 8 veckors in vitro- kultur innehöll den regenererade vävnaden upp till 50% torrsubstans (4% cellmassa, 15% glykosaminoglykaner och 31% kollagen). I PPLK-celler var spindelformade, en liten mängd glykosaminoglykaner och kollagen. I HSBC var celltillväxt 2 gånger mer intensiv än i PTCA. I in vivo-betingelser producerade kondrocyter odlade i HPVC och PPLC i 1 till 6 månader en vävnad som histologiskt liknade brosk. Implantat innehöll glykosaminoglykaner, kollagener av typ I och typ II.

Fostertjurkondrocyter odlades i porös hydrofob och hydrofil polyeten med hög densitet. Efter 7 dagar inkubation i båda substraten behöll cellerna en sfärisk form, huvudsakligen innehållande kollagen av typ II. Efter 21 dygn odlades det att den hydrofila matrisen innehåller mer typ II kollagen än den hydrofoba matrisen.

Broskvävnad kan också erhållas genom odling i ett monoskikt på Millicell-CM-filter. Förbeläggning av filtren med kollagen är nödvändig för fastsättning av konditorier. Histologisk undersökning av kulturen demonstrerar ackumulering av kondrocyter i ECM-innehållande proteoglykaner och kollagen av typ II. Kollagen typ I i en sådan kultur detekteras inte. Kondrocyter i den resulterande broskvävnaden har en sfärisk form, men på ytan av vävnaden är de något platta. Tjockleken hos den nybildade vävnaden ökade med tiden och berodde på initialtätheten hos monolagret hos celler. Under optimala odlingsförhållanden nådde tjockleken hos den broskiga vävnaden 110 μm, organisationen av dess celler och kollagen i ytan och djupa lager liknar den hos ledbrusk. VKM innehåller cirka 3 gånger mer kollagen och proteoglykaner. Efter 2 veckors odling noterades ackumuleringen av matrisen-sa, vilket gjorde det möjligt att extrahera vävnaden från filtret och använda den för transplantation.

Sims et al. (1996) studerade odlingen av kondrocyter i en polyetenoxidgelinkapslad polymermatris som tillåter ett stort antal celler att transporteras genom injektion. Sex veckor efter injektion i den subkutana vävnaden hos athymiska möss bildades ett nytt brosk vilket morfologiskt karaktäriserades av vit opalescens liknande hyalinbrusk. Data från histologiska och biokemiska studier indikerade förekomsten av aktivt proliferation av kondrocyter, vilka producerar ECM.

Explantation

Undersökning av broskvävnad används för att studera processer av ana- och katabolism i den, homeostas, resorption och reparation. Kondrocyter i broskvävnadsexplanter stöder den normala fenotypen och sammansättningen av ECM, liknande de i ledbrusk in vivo. Efter 5 dagar odling i närvaro av serum uppnås en konstant nivå av syntes och naturlig nedbrytning. Resorption kan accelerera vävnadskultur och i huvudkulturen med tillsats av serum med användning av ett antal medel, t ex IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivat av retinsyra eller aktiva syreradikaler. Att studera dess reparation broskskada induceras genom lösliga inflammatoriska mediatorer (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) eller fysikalisk bristning av matrisen.

Metoden för organotypiska kulturer är en modell för att studera in vitro- effekter av isolerade externa faktorer på kondrocyter och den omgivande matrisen. In vivo är kondrocyter sällan belägna i ECM och kontaktar inte varandra. Kulturen i det explanta ledbrusk behåller denna strukturella organisation, liksom de speciella interaktionerna mellan kondrocyterna och deras omgivande extracellulära miljö. Denna modell används också för att studera effekten av mekanisk stress, farmakologiska medel, tillväxtfaktorer, cytokiner, hormoner på broskets metabolism.

En annan fördel med brusk av vävnadsexplantering är frånvaron av kondrocytskador genom proteolytiska enzymer eller en mekanisk faktor, vilket är oundvikligt när celler isoleras. Receptorer och andra membranproteiner och glykoproteiner skyddas från skadliga faktorer.

[26], [27], [28], [29], [30]

Kultur av kondroner

Hondron - strukturella, funktionella och metaboliska ledbrosk enhet bestående av kondrocyt pericellulär matris och dess kompakta glödtråden kapsel och är ansvarig för homeostasen av matrisen. Kondronerna extraheras mekaniskt från brusk och uppsamlas genom flera successiva låghastighetshomogeniseringar. Isolerad från zonerna med olika djup hondrony brosk kan delas in i fyra kategorier: enkel hondron, tvilling hondrony, multipel (tre eller flera) linjärt anordnade hondrony (kolumn hondronov) hondronov överbelastning.

Enstaka kondroner finns vanligtvis i de mellanliggande skikten av intakt brosk, parat - vid gränsen mellan mellersta och djupa lager, är linjärt placerade flera kondondoner typiska för djupa lager av intakt brosk. Slutligen består kluster av kondondoner av slumpmässigt organiserade grupper av enkla och parade kondroner som behåller det aggregerade tillståndet efter homogenisering. Ackumuler av kondondoner är stora fragment av brosk, vanligen innehållande flera kondroner och radiellt placerade kollagenfibriller, dvs en typisk organisation som är karakteristisk för djupa lager av matrisen. Chondrons immobiliseras i en genomskinlig agaros, som tillåter att studera sin struktur, molekylär sammansättning och metabolisk aktivitet. Chondron-agarosystemet anses vara ett mikromodel av brosk, som skiljer sig från det traditionella kondrocyt-agarossystemet genom att en naturlig mikromiljö upprätthålls, det är inte nödvändigt att utföra sin syntes och montering. Kondrons kultur är en modell för att studera interaktioner mellan celler och matris i ledbrusk under normala och patologiska förhållanden.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]

Kultur av odödliga kondrocyter

För att skapa permanenta cellinjer används rekombinant DNA eller onkogeninnehållande virus som kan göra cellen "odödlig". Immortala kondrocyter har förmågan att oändlig proliferation upprätthålla en stabil fenotyp. F. Mallein-Gerin et al (1995) visade att onkogenen är SV40T-inducerad proliferation av mus kondrocyter vilka sålunda fortsätter att stabilt uttrycka den kollagener II, IX och XI typer, såväl som gemensamma och aggrecan bindningsprotein. Emellertid förvärvar denna cellinje förmågan att syntetisera kollagen typ I genom odling den i monoskiktskultur eller i en agarosgel.

W. Horton och medförfattare (1988) beskrev en rad odödliga celler med en låg nivå av kollagen typ II mRNA-uttryck. Dessa celler erhölls genom att transformera dem med ett mus-retrovirus innehållande I-myc- och y-ra-onkogener. Denna typ av celler är en unik modell för att studera interaktionerna av artikulärmatrisen i frånvaro av typ II-kollagen, såväl som regleringen av syntesen av kollagen av typ II.

Kondropyternas kultur med muterade eller borttagna gener är en lämplig modell för att studera deras fysiologiska funktion. Denna modell är särskilt lämplig för att studera rollen av specifika molekyler i broskmatrisorganisationer eller studera effekterna av olika regulatoriska faktorer på brosk-metabolism. Kondrocyter fjärr genen syntetiserad kollagen typ IX kollagenfibriller bredare än normalt, vilket tyder på att kollagen typ IX reglerar diametern av fibriller. Som jag noterade i kapitel 1, den nyligen funna genmutation COLAI kodar för typ II kollagen i familjer med primär generaliserad osteoartrit. För att studera effekten av mutant kollagen typ II i den artikulära matrisen R. Dharmrvaram et al (1997) utförs transfektion ( "kontaminering" en främmande nukleinsyra) defekt COL ₂ AI (arginin i position 519 är ersatt med cystein) i humana fetala kondrocyter in vitro.

System av kulturer. I foget samverkar brosk med celler av andra typer som finns i synovialmembranen, synovialvätska, ligament, subkondralbens. Metabolismen av kondrocyter kan påverkas av olika lösliga faktorer som syntetiseras av dessa celler. Så, arthritis ledbrusk förstörs av proteolytiska enzymer och fria radikaler, vilka produceras av synovialceller. Modeller har därför utvecklats för att studera komplexa interaktioner mellan brosk och omgivande vävnader, som kallas odling.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) var odlade kanin kondrocyter och osteoblaster i samodlingen systemet (COSTAR), i vilken cellerna separerades mikroporöst membran (0,4 mikron) möjliggör utbytet mellan de två celltyperna utan direkt kontakt. Denna studie visade förmågan hos osteoblaster att stimulera tillväxten av kondrocyter genom lösliga mediatorer.

AM Malfait och medförfattare (1994) undersökte sambandet mellan monocyter av perifert blod och kondrocyter. Denna modell är lämplig för att studera processer medierade av cytokiner, inflammatoriska artropati (reumatoid artrit, seronegativ spondylit, etc.). Författarna till modellen separerade cellerna med ett proteinbindande membran med porer 0,4 um i diameter. Studien fann att lipopolysackarid-stimulerade monocyter utarbetat iFNO IL-1-a, som inhiberar syntesen av kondrocyter aggrecan och bidrog till nedbrytningen av redan syntetiserade aggrecan aggregat.

K. Tada et al (1994) skapade en samodling modell där endotelceller i kollagen (I-typ) gel sattes in i den inre kammaren från den yttre kammaren separerad från denna med kondrocyter placerade i ett filter med en porstorlek av 0,4 mikron. I ett tillstånd av fullständig isolering från ytterkammaren bildade mänskliga endotelceller rör i en kollagengel i närvaro av EGF eller TGF-a. Med samtidig odling av båda typerna av TGF-celler inhiberades den beroende bildningen av rören genom endotelceller. Kondrocytinhiberingen av denna process eliminerades delvis av anti-TGF-beta-antikroppar. Det kan antas att TGF-beta som produceras av kondrocyterna, deprimerar vaskulärisering av själva brosket.

S. Groot och medförfattare (1994) odlade samtidigt kondrocyter från de hypertrofa och proliferativa zonen i benet hos en 16-dagars fetmus med bitar av hjärnvävnad. Efter 4 dagars odling observerades transdifferentiering av kondrocyter i osteoblaster och uppkomsten av osteoidbildning. Efter 11 dygn odlades en del av brosket av benvävnad och benmatrisen förkalkades delvis. Vissa neuropeptider och neurotransmittorer som produceras av hjärnvävnad påverkar ämnesomsättningen hos osteoblaster eller har receptorer på dem. Bland dem kan norepinefrin, vasoaktiv tarmpeptid, peptid associerad med kalcitoningenen, substans P och somatostatin isoleras . Odlade med kondrocyter kan bitar av hjärnvävnad producera några av dessa faktorer, vilket kan inducera processen med kondrocyttransdifferentiering i osteoblaster.

[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]

Inverkan av yttre faktorer på kondrocyternas kultur

Effekten av syre spänning på metabolismen av kondrocyter

I de flesta fall utvecklas kondrocytkulturer under betingelser med atmosfärisk syrgasspänning. Det är emellertid välkänt att in vivo kondrocyter existerar under hypoxiska betingelser och syrets spänning varierar med olika patologiska tillstånd. Under mognadsprocessen observeras signifikanta förändringar i blodtillförseln hos epifyserna. Eftersom vaskularisering varierar i olika områden av tillväxtplattan varierar syrgasspänningen i dem också. C. Brighton och R. Heppenstall (1971) visade att i syreplattans platta i kaniner är syrgasspänningen i den hypertrofa zonen mindre än i det omgivande brosket. Mätningar av vissa metaboliska parametrar har visat att kondrocyter kan reagera snabbt på lokala förändringar i syrekoncentration. Först med allt med låg syrgasspänning minskar dess förbrukning av kondrocyter. Med en minskning av syrspänningen från 21 till 0,04%, ökar glukosutnyttjandet, glykolysenzymaktiviteten och mjölksyrasyntesen ökas. Även med en låg syre-spänning förblir den absoluta mängden ATP, ADP och AMP stabil. Dessa data indikerar riktningen av kondrocytmetabolism för att maximera energibesparing. Ändå förändras den syntetiska aktiviteten och därmed processerna för reparation under hypoxi.

Hög syrgasspänning påverkar också metabolismen av kondrocyter, vilket medför en minskning av syntesen av proteoglykaner och DNA, nedbrytning av bruskmatrisen. Dessa effekter, som regel, åtföljs av produktionen av fria syreradikaler.

Påverkan av jonkoncentration och osmotiskt tryck av miljön på funktionen av kondrocyter

I den nativa brosk jonkoncentrationen är signifikant skild från den hos andra vävnader: natriumhalten i det extracellulära mediet är 250 - 350 mmol, och dess osmolaritet - 350-450 mOsm. När isolera kondrocyter från en videobandspelare och inkubera dem i en vanlig media (DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium - Dulbeccos Minimum Essential medium) osmolaritet - 250-280,7 mOsm) ändras kraftigt omgivningen av cellen. Dessutom är koncentrationen av kalcium och kalium i standardmedier mycket lägre än i nativ vävnad, och koncentrationen av anjoner är mycket högre.

Tillsats av sackaros till mediet leder till en ökning i dess osmolaritet och inducerar en övergående intracellulär ökning av koncentrationen av H ⁺ och kalciumanjoner i cytosolen. Sådana intracellulära förändringar kan påverka processerna för kondrocytdifferentiering och deras metaboliska aktivitet. J. Urban et al (1993) fann att införandet av ³⁵ 8-sulfat och ³ H-prolin isolerade kondrocyter inkuberade i DMEM standardmedium under 2-4 timmar, var endast 10% av den i den naturliga vävnaden. Syntesintensiteten nådde maximalt med osmolaritet hos det extracellulära mediet på 350-400 mosmol både i de nyligen isolerade kondrocyterna och i eksplantaten i den broskiga vävnaden. Dessutom ökade kondrocytvolymen med 30-40% efter att ha placerat isolerade celler i ett standard DMEM-medium av nämnda osmolaritet. Emellertid, när odlade kondrocyter för ej fysiologisk osmolaritet under 12-16 timmar, cellerna som är anpassade till den nya miljön genom att minska intensiteten av skjuvning är proportionell biosyntes osmolariteten hos det extracellulära mediet.

P. Borgetti et al (1995) undersökte effekten av osmolariteten hos det extracellulära mediet på tillväxten, morfologin, och biosyntesen av svin kondrocyter. Författarna uppvisade liknande biokemiska och morfologiska egenskaperna hos kondrocyter odlade i medium med en osmolaritet mOsm 0,28 och 0,38. När 0,48 mOsm osmolaritet av mediet under de första 4-6 timmarna av odling observerades minskning i cellproliferation och proteinsyntes, men uppstått därefter återställa dessa parametrar som så småningom nådde kontrollvärdena. Vid odling kondrocyter i ett medium med 0,58 mOsm osmolaritet celler förlorar deras förmåga att stödja fysiologisk intensitet proliferativa processer och efter 6 dagar antalet kondrocyter har minskat avsevärt. Med osmolaritet av mediet, 0,58 mosmol, observeras en djup hämning av proteinsyntes. Dessutom, när de odlas i medium med en osmolaritet mOsm 0,28-0,38 kondrocyter bibehåller fysiologisk fenotyp vid en högre osmolaritet (mOsm 0,48-0,58) signifikanta förändringar i cellmorfologi, som manifesterade förlustkaraktäristik fenotypen kondrocyter omvandling i fibroblastliknande celler, såväl som cellförlust, förmågan att montera matrisproteoglykaner. Resultaten av denna studie indikerar kondrocyternas förmåga att reagera på begränsade osmolalitetsoscillationer i den extracellulära miljön.

Förändringen i koncentrationen av andra joner kan också påverka biosyntesprocesserna i kondrocyter. Således ökar graden av införlivande av ³⁵ S (sulfat) med hälften med en ökning i koncentrationen av kaliumjoner från 5 mmol (koncentration i ett standard DM DM-medium) till 10 mmol (koncentration i VKM in vivo). Kalciumkoncentrationen under 0,5 mmol bidrog till framställning av kollagen genom mogna tjurkondrocyter, medan en koncentration av 1-2 mmol (motsvarande koncentrationen i standard DM DM-medium) orsakade en signifikant minskning av kollagensyntesen. En måttlig ökning av biosyntes observerades vid höga halter av kalcium (2-10 mmol). Olika katjoner deltar i bindningen av kondrocyter till VKM-proteiner. Således ger magnesium och manganjoner bindning till fibronektin och kollagen typ II, medan kalciumjoner inte deltar i bindningen av kondrocyter till proteiner. Således indikerar resultaten av de beskrivna studierna påverkan av förändringar i extracellulära joner av kalium-, natrium-, kalcium- och osmolaritet hos mediet på den biosyntetiska funktionen av kondrocyter inkuberade i standardmedier.

Inverkan av mekanisk stress på metabolism av kondrocyter

Immobilisering av leddet orsakar en reversibel atrofi av brosket, vilket indikerar behovet av mekaniska stimuli för den normala förloppet av metaboliska processer i ECM. I de flesta fall finns de cellodlingsmodeller som används under normala atmosfäriska tryckförhållanden. M. Wright och medarbetare (1996) visade att den mekaniska miljön påverkar metabolismen av kondrocyter, beror cellernas svar på intensiteten och frekvensen av den tryckkraft. Experiment med belastningen på de intakta explantat av ledbrosk in vitro visade en minskning av syntesen av proteiner och proteoglykaner under statisk belastning, dynamisk last medan stimulera dessa processer. De exakta mekanismerna för att genomföra de mekaniska belastnings effekter på brosk komplex och troligen relaterade till stam-celler, det hydrostatiska trycket, osmotiskt tryck, elektrisk potential och cellytereceptorer för matrismolekyler. För att studera effekten av var och en av dessa parametrar är det nödvändigt att skapa ett system där en parameter kan varieras oberoende. Exempelvis är en explant kultur inte lämplig för att studera celldeformation, men det kan användas för att studera den totala effekten av tryck på kronisk aktivitet hos kondrocyter. Komprimering av brosk leder till cell deformation och också tillsammans med förekomsten av hydrostatiska tryckgradienten, elektrisk potential, och fluidflödesförändring fysikalisk sådana faktorer som vatteninnehållet i matrisen, densiteten hos elektriska laddningen, nivån på osmotiskt tryck. Celldeformation kan studeras med användning av isolerade kondrocyter nedsänkt i en agaros eller kollagengel.

Flera system har utvecklats för att studera effekten av mekanisk stimulering på kondrocyternas kultur. Vissa forskare använder system för detta ändamål, där trycket appliceras på cellkulturen genom gasfasen. Till exempel JP Veldhuijzen et al (1979) med användning av ett tryck över atmosfärs av 13 kPa vid en låg frekvens (0,3 Hz) under 15 minuter, observerades en ökning av cAMP-syntes och proteoglykaner och sänka DNA-syntes. R. Smith m fl (1996) visade att den intermittenta exponering av primära kulturer av kondrocyter tjur hydrostatiskt tryck (10 MPa) efter 1 Hz under 4 timmar orsakade ökning av syntesen av aggrecan och kollagen typ II, medan den konstant tryck hade ingen effekt på dessa processer. Med användning av ett liknande system M. Wright et al (1996) rapporterade att den cykliska trycket på cellodlingen är associerad med hyperpolarisering av cellmembranet hos kondrocyter och aktivering av Ca ²⁺ -beroende kaliumkanaler. Sålunda medieras effekterna av cykliskt tryck av jonkanaler, aktiverade genom sträckning, i kondrocytmembranet. Responsen av kondrocyter till hydrostatiskt tryck beror på betingelserna för cellodling och frekvensen av den applicerade belastningen. Sålunda, cyklisk hydrostatiskt tryck (5 MPa) minskar införlivning av sulfat i kondrocyt monoskikt vid en frekvens av 0,05, 0,25 och 0,5 Hz, medan det för frekvenser över 0,5 Hz inkludering sulfat i brosk Explantation ökar.

M. Bushmann et al (1992) rapporterade att kondrocyter i en agarosgel-alterbiosyntes som svar på statisk och dynamisk mekanisk spänning på samma sätt som det odlade intakta organet. Författarna fann att mekanisk belastning genererar en hyperosmotisk stimulans följt av en minskning av pH i kondrocyterna.

Effekten av mekanisk sträckning kan studeras på en cellkultur nedsänkt i en gel. Sträckkraften kan skapas med hjälp av ett datorstyrt vakuum. När systemet är i vakuum i viss grad förlängs petriskålens botten med cellkulturen med en viss mängd, deformationen är maximal vid kanterna av koppens botten och är minimal i mitten. Sträckning överförs och odlas i en petriskål av kondrocyter. Med denna metod, Holm-vall K. Et al (1995) visade att odlade på kollagen (II typ) gel kondrosarkomceller ökade uttrycket av mRNA och ₂ -integrina. En ₂ p _r grin kan binda till kollagen typ II. Det anses vara en mekanoreceptor, eftersom den interagerar med aktinbindande proteiner, därigenom kopplar ECM och cytoskeletten.

Effekt av pH på kondrocyt metabolism

PH i den interstitiala vätskan av ECM hos den bruskiga vävnaden är surare än i andra vävnader. A. Maroudas (1980) bestämde pH hos ledbrusk vid 6,9. W. Diamant och medförfattare (1966) fann ett pH av 5,5 i patologiska tillstånd. Det är känt att kondrocyter lever vid låg PO2, vilket indikerar den viktiga rollen glykolys (95% av den totala glukosmetabolismen) i metabolism av dessa celler; glykolys åtföljs av produktion av en stor mängd mjölksyra.

Förutom försurning av miljön med produkterna av glykolys är matriskomponenterna själva av stor betydelse. Ett stort antal fasta negativa laddningen på de extracellulära proteoglykaner modifierar den joniska kompositionen: det finns en hög koncentration av fria katjoner (t ex H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) och låg koncentration av anjoner (t ex O2, NPHS). Vidare, under inverkan av mekanisk belastning inträffar utdrivning av vatten från ECM, vilket leder till ökade koncentrationer av fasta negativa laddningar och attrahera flera katjoner i matrisen. Detta följs av reduktion av pH-värdet i det extracellulära mediet, vilket påverkar intracellulärt pH, därigenom modifiera metabolismen av kondrocyterna. R. Wilkin och A. Hall (1995) studerade effekten av pH-värdet för de extracellulära och intracellulära miljö matris biosyntes isolerade bovina kondrocyter. De observerade en dubbel modifiering av matrissyntes med en minskning i pH. En liten minskning i pH (7,4 35 S0 ₄ och ³ H-prolin till kondrocyter, medan djupare surgörning (pH <7,1) inhiberar syntesen av 75% jämfört med kontroll. Att skapa samma låga pH-värdet (6,65) med ammoniumjoner orsakade en minskning av matrissyntesen med endast 20%. Indikerar dessa resultat att modifiering av pH-värdet hos den extracellulära matrissyntes medier kan inte bara förklaras av förändringar i intracellulärt pH-miljö. Vidare kondrocyter besitter förmågan att reglera intracellulära pH genom Na ⁺, H ⁺ växlare, Ca ⁺ -beroende C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS och H ⁺ / ATPas.

[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Effekt av mediets sammansättning för odling av metabolism av kondrocyter

Mediet för odling av kondrocyterna måste motsvara de experimentella betingelserna. Under de senaste åren har kalvserum använts för att optimera odlingsbetingelserna. Vid användning av serum måste dock flera viktiga punkter beaktas:

• extern tillväxt av celler från vävnadens periferi i organkulturer,
• variabiliteten av kompositionen av sera av olika serier,
• närvaron av okända komponenter i dem,
• ökad risk för störningar, artefakter i studien av påverkan av olika biologiska faktorer på cellens metaboliska aktivitet.

Ett exempel på det senare är studien av effekten av EGF på bruskondrocyter hos råtta. EGF stimulerade införlivandet av ³ H-tymidin och en ökning i DNA-halt i kulturen. Denna effekt var mer uttalad vid låga serumkoncentrationer (<1%) men i höga koncentrationer (> 7,5%) försvann effekten.

Det är välkänt att nivåer av syntes och nedbrytning i DMEM berikad med kalvserum ökas signifikant jämfört med in vivo-betingelser. Skillnader mellan in vivo och in vitro metabolism kan orsakas av skillnader mellan synovialvätskan och miljön där cellerna odlas. D. Lee et al. (1997) odlade kondrocyter av unga tjurar i agaros med användning av ett näringsmedium innehållande DMEM berikat med 20% kalvserum och en stor mängd normal allogen synovialvätska. Närvaron av synovialvätska i mediet inducerade en ökning av antalet proteoglykaner, upp till 80% av den totala mängden synovialvätska. De erhållna resultaten indikerar att synovialvätska i odling inducerar en metabolisk hastighet liknande den in vivo, med en hög nivå av syntes av glykosaminoglykaner och en låg nivå av celldelning.

G. Verbruggen et al (1995) visade att syntesen av ³⁵ S-arrpeKaHa humana kondrocyter odlade i agaros i DMEM utan serum var 20-30% av nivån för syntesen observerades i DMEM, kompletterat med 10% kalvserum. Författarna bestämma omfattningen med vilken IGF-1, IGF-2, TGF-P eller minskade produktionsinsulin aggrecan i medium utan serum. Författarna drog slutsatsen att det 100 ng / ml insulin, IGF-1 eller IGF-2 delvis reducerad syntes av aggrekan till 39-53% av kontrollnivåerna. Med en kombination av dessa faktorer har inga synergistiska eller kumulativa fenomen identifierats. På samma gång, 10 ng / ml av TGF-P i närvaro av 100 ng / ml insulin stimulerade syntes av aggrekan till 90% eller mer av referensnivån. Slutligen påverkades inte serumtransferrin, ensam eller i kombination med insulin, syntesen av aggrecan. När kalvserum ersattes med bovint serumalbumin, reducerades aggregeringshalten aggregerat signifikant. Berikning av mediet för insulinkultur, IGF eller TGF-P återställde delvis cellernas förmåga att producera aggrecanaggregat. I detta fall kan IGF-1 och insulin kunna upprätthålla homeostas i cellkulturer. Efter 40 dagars odling i medium med tillsats av 10-20 ng / ml IGF-1, var proteoglykansyntes bibehållas på samma nivå eller till och med högre i jämförelse med medium innehållande 20% kalvserum. Katabola processer fortskred långsamt i medium kompletterat med IGF-1 än i medium kompletterat med 0,1% albuminlösning, men något snabbare i medium kompletterat med 20% serum. I långlivade kulturer upprätthåller 20 ng / ml IGF-1 ett stabilt tillstånd av celler.

D. Lee et al (1993) jämförde effekten av sammansättningen av odlingsmedium (DMEM, DMEM + 20% kalvserum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) på DNA-syntes i en kultur av explantat brosk, enkelskiktsodling och i suspension i agaros . När odlade i agaros i närvaro av serum observerade författarna en tendens att gruppera kondrocyter i stora kluster. Celler odlade utan serum och med IGF1, bibehålla en cirkulär form i agaros, uppsamlades i små grupper, men inte bildar stora aggregat. I monoskiktet var syntesen av DNA signifikant högre i seruminnehållande media än i mediet berikat med IGF-1; Syntesen av DNA i den senare var mycket högre än i den icke-riktade miljön. När odla kondrocyter i suspension i agaros i okoncentrerat medium och i ett medium med IGF-1, ingen skillnad i DNA-syntes. Samtidigt uppslamningen odla kondrocyter i agaros i medium kompletterat med serum, åtföljdes av en ökad inkorporering av radionukleotid ³ H-tymidin jämfört med andra miljöer.

C-vitamin är nödvändigt för aktivering av enzymer som är involverade i bildandet av en stabil spiralstruktur av kollagenfibriller. Chondrocyter, bristfälliga med avseende på askorbinsyra, syntetiserar underhydroxylerade, icke-spiralformiga prekursorer av kollagen, som långsamt utsöndras. Införandet av askorbinsyra (50 μg / ml) orsakar hydroxylering av kollagentyperna II och IX och deras utsöndring i normala mängder. Tillsatsen av vitamin C påverkade inte syntesnivået av proteoglykaner. Följaktligen regleras sekretionen av kollagen oberoende av utsöndringen av proteoglykaner.

[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64], [65]