En ampull, två mål: Bärbar CRISPR-baserad tuberkulosdiagnos med 100 % känslighet

En artikel om ett portabelt tuberkulostest som kan göras direkt från sputum, utan komplex utrustning, publicerades i Science Advances. Isotermisk DNA-amplifiering och CRISPR-avläsning kombineras i ett enda provrör; två konservativa M. tuberculosis-insertioner (IS6110 och IS1081) testas samtidigt, plus en mänsklig gen som intern provkontroll. I ett litet "blind" test på kliniska prover gav testet 100 % sensitivitet (6/6) och 100 % specificitet (7/7) jämfört med odling; detektionsgränsen är ~69–81 CFU/ml i simulerat sputum. Resultatet kan ses på en papperstestremsa och reagensen frystorkas (förvaras utan "kylkedja").

Bakgrund

Enligt WHO kommer tuberkulos att döda cirka 1,25 miljoner människor år 2023; tuberkulos har återigen blivit den vanligaste dödsorsaken, med uppskattningsvis 10,8 miljoner fall. Detta gör tillgänglig och snabb diagnostik avgörande, särskilt i resursbegränsade miljöer.

• Nuvarande tester är en kompromiss mellan noggrannhet, hastighet och pris. Den "guldstandard"-kulturen är mycket noggrann men långsam; mikroskopi är snabb men okänslig; PCR-plattformar som Xpert MTB/RIF Ultra är betydligt känsligare (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), men kräver dyr utrustning och patroner, vilket begränsar täckningen.
• Varför isotermisk och CRISPR. Isotermisk RPA-amplifiering fungerar vid 37–42 °C och kräver inte termiska cykler – bekvämt "i fält". CRISPR-avläsning (Cas12/13) ger artspecificitet och möjliggör visuellt lateralt flöde ("strip") utan komplex optik. Sammantaget är detta vägen till bärbara och billiga PVR-tester.
• Varför två MBT-mål samtidigt (IS6110 + IS1081). IS6110 är en multikopieinsats av M. tuberculosis- komplexet, men vissa linjer har få kopior, och tester för enbart IS6110 kan "missa". Att lägga till en andra IS1081-insats minskar risken för falskt negativa resultat.
• Varför intern mänsklig kontroll. Utandningsprover kan innehålla hämmare och "dåliga" prover. Endogen mänsklig kontroll (t.ex. RNase P/genomiskt DNA) bekräftar att materialet är adekvat och att reaktionen inte undertrycks – annars kan resultatet inte anses vara negativt.
• Enpottsformatet är viktigt i sig. Det minskar antalet steg, minskar risken för kontaminering och underlättar arbete utanför labbet. Sådana metoder för tuberkulos har redan visat sig vara användbara; det nya arbetet utvidgar idén till ett format med dubbla mål med interna kontroller, plus demonstrerar frystorkning av reagenser och en remsläsare.
• Vad är värdet av den aktuella artikeln? Författarna demonstrerade detektion direkt från sputum efter den enklaste provberedning, detektionsgränsen vid ~70–80 CFU/ml i simulerat sputum och 100 % sensitivitet/specificitet på en liten blinduppsättning av kliniska prover – en bra "teknisk demonstration" för ytterligare multicentervalideringar.

Hur fungerar detta

• Forskarna kombinerade RPA (snabb isotermisk amplifiering av genetiskt material vid 37 °C) med de "skärande" enzymerna Cas13a/Cas12a. Efter att ha valt ut styr-RNA:erna konfigurerade de systemet för att rikta in sig på två MBT-mål samtidigt och parallellt med mänskligt DNA (och kontrollera att det finns material i provet överhuvudtaget och att reaktionen inte har "avstannat").
• All kemi hamnar i ett provrör; efter inkubation avläses resultatet antingen med en fluorimeter eller på en lateral flödesremsa – i princip som ett expresstest.
• Sputumbearbetning har förenklats till uppvärmning och en kort centrifug – utan nukleinsyraextraktorer. För de mest begränsade förhållandena diskuterar författarna till och med manuella alternativ till centrifugen.

Vad testerna visade

• Detektionsgräns: 69,0 CFU/ml (stam H37Rv) och 80,5 CFU/ml (BCG) i "spike"-sputum. Ingen korsreaktivitet med andra bakterier/svampar detekterades.
• Klinisk miljö (blindade prover): på 13 prover från verklig praxis - 100 % sensitivitet (6/6) och 100 % specificitet (7/7) i förhållande till sådd. Som jämförelse visade GeneXpert Ultra på samma kit 100 % respektive 86 %.
• Tekniska nyanser: av de två avläsningsalternativen fungerade Cas13a bättre (för "one-pot"-formatet är det känsligare än Cas12a). Dessutom minskar parallell testning av två Mtb-mål risken för falska resultat.

Varför är detta nödvändigt?

Dagens tester är en kompromiss mellan noggrannhet, hastighet och tillgänglighet: odling är mycket exakt men långsam; provtagning med pinnar är snabb men felaktig; PCR-system som GeneXpert är exakta och snabba men kräver dyra instrument och patroner. Den nya CRISPR-metoden syftar till att minska gapet: fältdiagnostik som arbetar vid 37 °C, med avläsningar av pappersremsor och möjligheten att förvara reagenser utan kylning.

Begränsningar och vad som händer härnäst

Detta är en tidig demonstration på en liten klinisk uppsättning – stora multicentertester behövs (inklusive HIV-saminfektion, hos barn, med paucibacillära former och olika MBT-linjer). Författarna noterar separat att i själva "fältversionen" måste bordscentrifugen ersättas med en helt manuell lösning. Men själva arkitekturen – "två mål + intern kontroll" i ett provrör – har redan bevisat sin funktionalitet och ger en tydlig väg till förfining för massanvändning.

Källa: Alexandra G. Bell et al. Ett effektiviserat CRISPR-baserat test för tuberkulosdetektering direkt från sputum, Science Advances, online 6 augusti 2025 (Vol. 11, Nummer 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206